Citogenética Molecular

En los últimos 20 años, el laboratorio de citogenética molecular ha participado del desarrollo progresivo de las investigaciones en citogenética clínica, contribuyendo a la formación de nuevos profesionales y a la comprensión de las bases genéticas de los trastornos del desarrollo. El estudio de cambios cromosómicos estructurales submicroscópicos, ha sido el principal foco de la investigación permitiendo aportar datos importantes sobre las bases genéticas de los trastornos neurológicos y cognitivos de enfermedades genéticas con Déficit Intelectual y/o Autismo. Las metodologías de análisis utilizadas han transitado desde la microscopía de luz a la citogenética molecular; con la utilización de herramientas de biología molecular como hibridación in situ fluorescente (FISH), PCR, MS-PCR, Southern Blot, MLPA y secuenciación génica, resultando en un aumento dramático en la resolución y la detección de variaciones mínimas en la estructura cromosómica, como responsables de una amplia gama de fenotipos alterados y no alterados.

La principal contribución de la citogenética molecular, basada en la utilización de FISH con sondas específicas de cromosomas, la ha convertido en una poderosa herramienta diagnóstica, de uso pre y post natal, detectando aberraciones cromosómicas numéricas y estructurales, que escapan al análisis convencional. Así es posible reconocer aberraciones cromosómicas complejas, reordenamientos cromosómicos crípticos, microdeleciones o microduplicaciones de menos de una megabase (Mb), así como anomalías que afectan a regiones del genoma con “imprinting”, como responsables de las principales afecciones genéticas de nuestra población.

En los últimos 20 años, el laboratorio de citogenética molecular ha participado del desarrollo progresivo de las investigaciones en citogenética clínica, contribuyendo a la formación de nuevos profesionales y a la comprensión de las bases genéticas de los trastornos del desarrollo. El estudio de rearreglos cromosómicos estructurales submicroscópicos, ha sido el principal foco de la investigación permitiendo aportar datos importantes sobre las bases genéticas de los trastornos neurológicos y cognitivos de enfermedades genéticas con Déficit Intelectual y/o Autismo. Las metodologías de análisis utilizadas han transitado desde la microscopía de luz a la citogenética molecular,  con la utilización de herramientas de biología molecular como hibridación in situ fluorescente (FISH),  reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR sensible a metilación (MS-PCR), amplificación múltiple de sondas (MLPA), análisis directo de genes por Southern Blot y análisis genómico de microdeleciones y microduplicaciones por hibridación comparativa del genoma (Microarray CGH).  Esto ha traído como consecuencia el aumento dramático en la resolución y la detección de variaciones mínimas en la estructura cromosómica, como responsables de enfermedades genéticas frecuentes. Figura 1

Microarray CGH.
Esta nueva tecnología implementada como contribución al Cariotipo Molecular, permite la detección de aberraciones cromosómicas complejas, reordenamientos cromosómicos crípticos, microdeleciones o microduplicaciones de menos de 1 megabase (Mb), como responsables de las principales afecciones genéticas de nuestra población.
El análisis e interpretación de resultados se realiza en nuestro laboratorio, utilizando la plataforma de microarrays SurePrint G3 Unrestricted CGH ISCA v2,  en matrices de 8 × 60K. Esta plataforma contiene aproximadamente 60.000 sondas CGH de 60pb que abarcan todo el genoma humano con una cobertura mayor de sondas en regiones subteloméricas, regiones de microdeleciones/duplicaciones, genes conocidos de haploinsufiencia y regiones asociadas a discapacidad intelectual ligada al X, pudiendo detectar desbalances desde 25 Kb en dichas regiones. Así este tipo de análisis genómico se ha convertido en una poderosa herramienta diagnóstica, de uso pre y post natal, pudiendo detectar alteraciones genómicas que escapan al análisis convencional. Para un mejor análisis e interpretación de resultados mCGH, es necesario conocer las características clínicas del paciente que deben ser informadas en una Ficha (adjunta) y enviada al laboratorio junto con la muestra del paciente.

Diagnóstico de mutaciones del gen FMR1, Síndrome X frágil (SXF).
Hoy día las nuevas aproximaciones al diagnóstico molecular del SXF nos permiten definir mejor el tipo de alteraciones que producen el SXF y los trastornos asociados: Temblor y Ataxia (FXTAS) y Falla Ovárica Prematura (FXPOI). Además de los métodos de diagnóstico tradicionales PCR y Southern Blot, contamos con el test Amplidex®, desarrollado con tecnología de Asuragen, con mayor sensibilidad que el Southern blot. Este método consiste en una reacción de PCR, a partir de ADN extraído desde la muestra de sangre del paciente, luego en el secuenciador de Applied Biosystems se determina el tamaño del fragmento obtenido y a partir de ese tamaño se determina el número de repetidos CGG (Figura 2). La ventaja de esta metodología es que permite detectar hasta 1300 repeticiones CGG y las interrupciones AGG, fundamentales al momento de asesorar a las familias sobre los riesgos de dicha expansión.

Test de Metilación, Síndromes de Prader Willi (SPW) y Angelman (SA).
El Test de Metilación es la primera aproximación que se debe utilizar en el diagnóstico de los SPW y SA. Este método está basado en un PCR sensible a la metilación, a partir del segmento cromosómico 15q11-13. Previo al PCR se realiza la modificación del ADN del paciente por Bisulfito, de manera tal que en las personas normales se obtienen dos productos de PCR uno que corresponde al alelo materno metilado y el otro al alelo paterno no metilado. En los casos de SPW se detecta sólo el alelo materno y en el SA se observa sólo el alelo paterno.

MLPA (Amplificación Múltiple de Sondas Dependientes de Ligación)
es un método de PCR múltiple que permite a través de un análisis cuantitativo detectar  cambios en el número de copias de uno o más exones de un gen o  genes asociados a ciertas patologías. Los productos de amplificación resultantes de cada SALSA MLPA oscilan entre 130 y 480 nt de longitud y son analizados por electroforesis capilar. Al comparar el patrón de picos obtenido de la muestra en estudio con las muestras de referencia, es posible  determinar las secuencias que muestran números de copias alterados. Así MLPA permite identificar aberraciones en genes únicos que son demasiado pequeños para ser detectados por FISH y que son la causa de desórdenes genéticos frecuentes como: CMTA1 Charcot Marie Tooth 1A, HNPP (Neuropatía hereditaria sensible a la presión), Rearreglos subteloméricos y otras.

FIGURA 1.  Estudios moleculares complementarios a la citogenética clásica disponibles en el laboratorio de Genética Molecular del INTA



FIGURA 2. Perfil electroforético del PCR Amplidex ® que permite detectar las mutaciones del gen FMR1

 

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